The value of fasting in the diagnosis of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency / O valor do jejum no diagnóstico da deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia média

ABSTRACT Female patient carrier of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MCADD) with recurrent clinical episodes of hypoglycemia and altered level of consciousness, presented changes in blood acylcarnitine profile by tandem mass spectrometry and in the urinary organic acid analysis by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). This case demonstrates the importance of fasting prior biological sample collection (when possible) when MCADD is suspected, and emphasizes that the time/momentum of biological sample collection is crucial to diagnosis, considering the possibility that MCADD is underdiagnosed in Brazil.

RESUMEN Paciente portadora de deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCADD) con episodios clínicos recurrentes de hipoglucemia y alteración de consciencia presentó mudanzas en el perfil de acilcarnitinas en la sangre con técnicas de espectrometría de masas en tándem y en el análisis de ácidos orgánicos urinarios mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Este caso demuestra la importancia de la toma de muestras biológicas en ayunas (se posible) cuando se sospecha de MCADD y destaca que el tiempo/momento de extracción de la muestra biológica es valioso para el diagnóstico, considerando la posibilidad de que la MCADD es subdiagnosticada en Brasil.

RESUMO Paciente portadora de deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia média (MCADD), com episódios clínicos recorrentes de hipoglicemia e alteração de consciência, apresentou alterações no perfil de acilcarnitinas em sangue por espectrometria de massas em tandem e na análise de ácidos orgânicos urinários por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. Este caso demonstra a importância da coleta de amostra biológica em jejum (se possível) quando há suspeita de MCADD e ressalta que o tempo/momento de coleta da amostra biológica é importante para o diagnóstico, considerando a possibilidade de a MCADD ser subdiagnosticada no Brasil.

Reference values of amino acids, acylcarnitines and succinylacetone by tandem mass spectrometry for use in newborn screening in southwest Colombia / Valores de referencia de aminoácidos, acilcarnitinas y succinilacetona por espectrometría de masas en tándem para su uso en el tamizaje neonatal en el suroccidente de Colombia

Abstract Introduction: Inborn errors of metabolism (IEM) represent an important public health problem due to current diagnosis and treatment limitations, poor life quality of affected patients, and consequent untimely child death. In contrast to classical methods, tandem mass spectrometry (MS/MS) has allowed simultaneous evaluation of multiple metabolites associated with IEM offering higher sensitivity, low false positive rates and high throughput. Aims: Determine concentration levels for amino acids and acylcarnitines in blood of newborns from Colombia, to establish reference values for further use in diagnosis of IEM. Methods: Implementation of a method to determine amino acids, acylcarnitines and succinylacetone in newborn dried blood spots using MS/MS, and its application in a cross-sectional study conducted in 891 healthy neonates from Cali and Quibdo cities is described. Results: fifty-seven analytes that allow the diagnosis of more than 40 different pathologies were tested. The method showed to be linear, precise and accurate. Healthy neonates 1-18 days of age were included, 523 from Cali and 368 from Quibdo; 52% male and 48% female. Age-related differences on the concentration levels of amino acids and acylcarnitines were observed whereas no significant differences by gender were found. Conclusion: The study has contributed to reveal the usual concentration levels of amino acids, acylcarnitines and succinylacetone that could be used as reference for the establishment of a newborn metabolic screening program in Colombia.

Resumen Introducción: Los Errores Innatos del metabolismo (EIM) representan un importante problema de salud pública debido a limitaciones en el tratamiento y diagnóstico oportuno, la pobre calidad de vida de los pacientes afectados, así como la muerte infantil prematura. Comparada con los métodos clásicos, la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) ha permitido la evaluación simultánea de múltiples metabolitos asociados con EIM, con una alta sensibilidad, baja proporción de falsos positivos y alto rendimiento. Objetivos: Determinar los niveles de concentración de aminoácidos y acilcarnitinas en sangre de recién nacidos de Colombia, para establecer los valores normales para usarlos como referencia en el diagnóstico de EIM. Métodos: Aquí, se describe la implementación de un método para determinar aminoácidos, acilcarnitinas y succinilacetona en gotas de sangre seca de recién nacidos usando MS/MS, y su aplicación en un estudio de corte transversal realizado en 891 neonatos sanos de las ciudades de Cali y Quibdó. Resultados: Se evaluaron 57 analitos que permiten el diagnóstico de más de 40 patologías diferentes. El método mostró ser lineal, preciso y exacto. Se incluyeron neonatos sanos de 1-18 días de edad, 523 de Cali y 368 de Quibdó, 52% hombres y 48% mujeres. Se observaron diferencias en los niveles de concentración de aminoácidos y acilcarnitinas relacionadas con la edad, mientras que no se encontraron diferencias significativas por sexo. Conclusión: El estudio ha contribuido a revelar los niveles usuales de concentración de aminoácidos, acilcarnitinas y succinilacetona que pueden ser usados como referencia para el establecimiento del programa de tamizaje neonatal metabólico en Colombia.

Aplicación de la espectrometría de masas en tandem en el tamiz neonatal de los errores innatos del metabolismo / Use of tandem mass spectrometry for the newborn screening of inborn errors of metabolism / Aplicação da espectrometria de massas em tandem no screening tamiz neonatal dos erros inatos do metabolismo

La aplicación de la espectrometría de masas en tandem en el diagnóstico de los errores innatos del metabolismo ofrece la posibilidad de ampliar el número de enfermedades que son tamizadas durante el periodo neonatal. Esta tecnología permite detectar, con gran sensibilidad, especificidad y rapidez, más de 30 enfermedades metabólicas en un mismo ensayo a partir de un único disco de sangre seca sobre papel de filtro. Para esto se realiza el análisis combinado del perfil de aminoácidos y acilcarnitinas sin requerir, generalmente, de sistemas de cromatografía adicionales. El procesamiento analítico que actualmente se utiliza en los diferentes laboratorios de tamiz es relativamente homogéneo.

The use of tandem mass spectrometry in the diagnosis of inborn errors of metabolism has the potential to expand newborn screening programmes to include many different diseases. This technique can quickly detect, with great specificity and sensibility, more than 30 diseases using the same punch of dried blood in filter paper through the combined analysis of acylcarnitines and amino acid mass spectra profile. The detection of a particular disease this way could be made without the need of a chromatographic system. The analytical analyses in current use by different screening laboratories are very similar.

A aplicação da espectrometria de massas em tandem no diagnóstico dos erros inatos do metabolismo oferece a possibilidade de ampliar os programas de screening neonatal para incluir maior número de doenças. Esta tecnologia permite detectar, com grande sensibilidade, especificidade e rapidez, mais de 30 doenças metabólicas em um mesmo ensaio a partir de um único disco de sangue seco sobre papel de filtro. Para isso é realizada a análise combinada do perfil de aminoácidos e acilcarnitinas sem precisar, geralmente, de sistemas de cromatografia adicionais. O processamento analítico que atualmente è utilizado nos diferentes laboratórios de screening é relativamente homogêneo.

Effect of anticaagulant type during the blood smple collection process on the determination of the acylcarnitine profile in blood and plasma / Efcto del tipo ddeanticoagulante utilizado en la toma de muestrass, sobre la determinación del perfil de acilcarnitinas en sangre y plamma

Background: the collection process for blood sampling is a very important factor that can influence the final results of some laboratory tests. The acylcarnitine determinations in blood are usually used for diagnosis and follow up of patients suffering certain inherited metabolic illnesses. Objective: this study analyzed the possible influence of the type of anticoagulant used in blood sampling on the acylcarnitine profile. Methodology: blood and plasma samples were collected using anticoagulants such as: lithium heparin, potassium EDTA, sodium fluoride-potassium oxalate, and sodium citrate. Samples were also collected without the use of anticoagulants. Acylcarnitine levels were assessed for each sample via tandem mass spectrometry. Results: no significant differences were found among the anticoagulant used. Conclusion: the type of anticoagulant has no effect on the acylcarnitine determination on blood or plasma. For this type of analysis any of the above mentioned anticoagulants can be used. Abbreviations: ESI-MS/MS, electrospray injection tandem mass spectrometry; IEM, innate errors of metabolism.

Antecedentes: la toma de muestras de sangre es un factor importante que puede influir los resultados finales de algunas pruebas de laboratorio. Las determinaciones de acilcarnitinas en sangre son utilizadas corrientemente para el diagnóstico y seguimiento de pacientes que sufren enfermedades metabólicas hereditarias. Objetivo: el presente estudio analizó la posible influencia del tipo de anticoagulante utilizado en la toma de la muestra de sangre, sobre el perfil de acilcarnitinas obtenido. Metodología: muestras de sangre y plasma fueron obtenidas utilizando heparina, potasio-EDTA, fluoruro de sodio-oxalato de potasio, y citrato de sodio y sin anticoagulante. Resultados: no fue encontrada diferencia estadísticamente significativa entre los anticoagulantes utilizados. Conclusión: el tipo de anticoagulante no tiene efecto sobre la determinación de acilcarnitinas en sangre o plasma. Para este tipo de análisis, puede ser utilizado cualquier anticoagulante de los antes mencionados. Abreviaturas: IEE-MS/MS, inyección de electrospray espectrometría de masas en tándem; EIM, errores innatos del metabolismo.

Effect of addin the internal standard to bloodsamples, prior to the preparatiion of blood spots for acylcarnitine aaalysis / Efeco de la adicción del estandar inerno a muestras de sangre antess de la preparación de manchas de sangre para el analisis de acylcarnitinas

Background: some general factors can influence when determining acylcarnitines through tandem mass spectrometry. Objective: to study the effect of adding the internal standard to blood samples before the preparation of filter paper cards compared with the addition of internal standard after having the filter paper cards prepared for determining acylcarnitines in blood for tandem mass spectrometry. Methodology: two groups of blood samples were prepared: group one without adding internal standard before the preparation of filter paper cards, and group two adding internal standard prior to the preparation of filter paper cards. Subsequently the acylcarnitines profile was measured using tandem mass spectrometry. Results: the recovery of acylcarnitines during extraction for the samples which were not added the internal standard before the preparation of the filter paper cards was 48% while for the samples that were added the internal standard the recovery percentage was 96% which shows a significant difference between the two groups. Conclusion: the ideal extraction process showing the highest acylcarnitines recovery level happens by adding the internal standard to the sample prior to the preparation of filter paper cards. However, for diagnostic purposes, filter paper cards containing samples without internal standard are normally received for the acylcarnitines analysis and, therefore, the method used to add the internal standard after preparing the samples on filter paper without internal standard is appropriate for determining acylcarnitines in blood. Abbreviations: ESI-MS/MS, Electrospray and tandem mass spectrometry.

Antecedentes: algunos factores generales pueden influir en la determinación de acilcarnitinas por espectrometría de masas en tándem. Objetivo: estudiar el efecto de agregar el estándar interno a las muestras de sangre antes de la preparación de las tarjetas en papel de filtro, comparado con la adición del estándar interno luego de preparar las tarjetas en papel de filtro sobre la determinación de acilcarnitinas en sangre por espectrometría de masas en tándem. Metodología: dos grupos de muestras de sangre fueron preparados: al grupo uno no le fue adicionado el estándar interno antes de la preparación de las tarjetas en papel de filtro, mientras que al grupo dos sí, y posteriormente se midió el perfil de acilcarnitinas por espectrometría de masas en tándem. Resultados: la recuperación de acilcarnitinas durante la extracción para las muestras a las cuales no se les agregó el estándar interno antes de la preparación de las tarjetas en papel de filtro fue del 48%, mientras que con las muestras a las cuales se les adicionó el estándar interno se obtuvo un porcentaje de recuperación del 96%, observándose una diferencia significativa entre los dos grupos. Conclusión: el proceso de extracción ideal que presenta el máximo nivel de recuperación de acilcarnitinas se da agregando el estándar interno a las muestras de sangre antes de preparar las tarjetas en papel de filtro. Sin embargo, con fines diagnósticos, las tarjetas de papel de filtro que contienen muestras de sangre sin estándar interno son recibidas para el análisis de acilcarnitinas y, por lo tanto, el método mediante el cual se agrega el estándar interno luego de preparar las muestras en papel de filtro sin estándar interno es adecuado para la determinación de acilcarnitinas en sangre. Abbreviations: ESI-MS/MS, Electrospray tandem mass spectrometry.

Hidrólisis de acilcarnitinas durante el análisis en sangre y plasma por espectrometría de masas en tandem / Hydrolysis of acylcarnitines during measurement in blood and plasma by tandem mass spectrometry

La determinación de acilcarnitinas en sangre es una herramienta importante para el diagnóstico de algunas enfermedades hereditarias, así como deficiencias metabólicas secundarias. Bajo las condiciones acídicas y la alta temperatura utilizadas durante el proceso de derivatización, es posible que pueda ocurrir algún grado de hidrólisis de acilcarnitinas, lo cual puede potencialmente interferir con las determinaciones de la carnitina libre. El objetivo del presente estudio fue investigar la hidrólisis de las acilcarnitinas (de cadena corta, media y larga) durante el proceso de derivatización y analizar su efecto sobre la determinación de carnitina libre. El porcentaje de hidrólisis fue de 27% para acilcarnitinas de cadena corta, 17% para acilcarnitinas de cadena media y 5% para acilcarnitinas de cadena larga. Estos resultados pueden ocasionar un incremento en los niveles de carnitina libre de las muestras analizadas.

The measurement of acylcarnitines in blood is an important tool for diagnosis of some inherited metabolic diseases and secondary metabolic deficiencies. Under the acidic conditions and the high temperature used for the derivatisation process, it is feasible that some degree of hydrolysis of acylcarnitines to free carnitine may occur and therefore potentially interfere with free carnitine measurements. The objective of the present study was to investigate the hydrolysis of acylcarnitines (short-chain-, medium-chain, and long chain acylcarnitines) during derivatisation process and to analyse its effect on free carnitine measurement. The average percentage of hydrolysis was 27% for short-chain acylcarnitines, 17% for medium-chain acylcarnitines, and 5% for long-chain acylcarnitines. These results can increase the free carnitine levels in the analysed samples.

Effect of acetoiitrile concentration on acylcaritines measurement by tandem maass spectrometry / Efecto de las concentraciones de acetonitrilo en la determinaciónde acilcarnitinnas mediante espectrometría de masas en tándem

Background: the several steps for acylcarnitine analysis by tandem mass spectrometry such as extraction, derivatisation, injection and others, can be influenced by some technical factors improving or impairing the levels of detection. Objective: the present study evaluated the effect of different concentrations of the acetonitrile used during blood acylcarnitines measurement on the sensitivity obtained during the analysis. Methodology: prior to acylcarnitine analysis by tandem mass spectrometry, samples were re-dissolved in different acetonitrile in water dilutions [50, 60, 70, 80, 90, and 100% (v/v)] and each single blood specimen was processed five times for each dilution. Results: it was observed that by increasing the concentration of acetonitrile the intensity of acylcarnitine peaks significantly increased. However at the highest concentrations of acetonitrile, this reacted with the polystyrene material of the microtitre plates, and resulted in peaks appearing in acylcarnitine profiles, specifically at m/z 302. Conclusion: a mixture of 70% v/v acetonitrile/water is recommended to use as optimum solvent to dissolve the extracts prior to blood acylcarnitine analysis by tandem mass spectrometry.

Antecedentes: las diferentes etapas que conforman el análisis de acilcarnitinas por espectrometría de masas en tándem, tales como extracción, derivatización, inyección y otras, pueden ser influenciadas por algunos factores técnicos incrementando o disminuyendo los niveles de detección. Objetivo: el presente estudio evaluó el efecto de la concentración del acetonitrilo utilizado durante la determinación de acilcarnitinas en sangre, sobre la sensibilidad obtenida durante el análisis. Metodología: antes del análisis de acilcarnitinas por espectrometría de masas en tándem, las muestras fueron disueltas en diferentes disoluciones de acetonitrilo en agua [50, 60, 70, 80, 90, and 100% (v/v)] y cada espécimen de sangre fue procesado 5 veces para cada dilución. Resultados: se observó que a medida que se incrementan los niveles de acetonitrilo, la intensidad de los picos de acilcarnitinas se incrementan significativamente. Sin embargo, a las concentraciones más altas de acetonitrilo, éste reacciona con el poliestireno de las bandejas, apareciendo picos en el perfil de acilcarnitinas, específicamente a m/z 302. Conclusión: una mezcla al 70% v/v acetonitrilo/agua, se recomienda para usar como solvente óptimo, para la disolución de los extractos antes del análisis de acilcarnitinas en sangre mediante espectrometría de masas en tándem.

Tráfico de acyl- CoA de membrana y niveles remanentes en glóbulos rojos, plasma y suero, analizados por espectrometría de masas en tandemso de la espectrometría de masas en tándem / Membrane ACYL-CoA traffic and remaning levels in red blood cells, plasma and serum analysed

Existe un cuestionamiento permanente acerca del fluido ideal para el análisis de carnitina y acilcarnitina por medio de la espectrometría de masas en tándem. El presente estudio evalúa el porcentaje de carnitina y acilcarnitinas en glóbulos rojos y la relación con el contenido de carnitina y acilcarnitina en la sangre, plasma y suero. Se centrifugaron muestras de sangre humana, se extrajeron plasma y suero, y se lavaron los glóbulos rojos con diferentes soluciones isotónicas. Se resuspendió el pellet en PBS para la preparación de tarjetas y análisis por espectrometría de masas en tandem. Se encontró que la carnitina y las acilcarnitinas de cadenas corta, media y larga, permanecen en los glóbulos rojos en porcentajes promedio de 43,4; 48;49; y 70% respectivamente. Se encontró una diferencia significativa entre los niveles de carnitina y acilcarnitina en la sangre comparado con sus niveles en plasma o suero (p<0,05). Dada la asociación de la carnitina y las acilcarnitinas con los glóbulos rojos, parece ser que ni la plasma ni el suero son el material ideal para el análisis de carnitina y acilcarnitinas.

There has been a permanent question about the ideal fluid for carnitine and acylcarnitine analysis by tandem mass spectrometry. The present study evaluates the percentage of carnitine and acylcarnitines in red blood cells and the relationship with the carnitine and acylcarnitines content in whole blood, plasma, and serum. Human blood samples were centrifuged, plasma or serum extracted, and blood cells were washed with different isotonic solutions. The final pellet was resuspended in PBS for card preparation and tandem mass spectrometry analysis. It was found that carnitine, short-chain, medium-chain and longchain acylcarnitines remain in red blood cells at average percentages of 43.4; 48; 49; and 70% respectively. A significant difference was found between carnitine and acylcarnitine levels in whole blood compare to its levels in plasma or serum (p<0.05). As carnitine and acylcarnitines remained associated with the blood cells, it seems therefore that plasma (or serum) is not the ideal material for the analysis of carnitine and acylcarnitines.

Hiperinsulinismo na infância: quando apenas uma dosagem de insulina não é suficiente / Hyperinsulinism in infancy and childhood: when an insulin level is not always enough

INTRODUÇÃO: A hipoglicemia em bebês e crianças pode causar convulsões, atraso de desenvolvimento e dano cerebral permanente. O hiperinsulinismo (HI) é a causa mais comum de hipoglicemia, seja transitória ou permanente. A HI é caracterizada pela secreção inadequada de insulina, o que resulta em hipoglicemia persistente, de leve a grave. As diferentes formas de HI representam um grupo de doenças clínica, genética e morfologicamente heterogêneo. CONTEÚDO: Hiperinsulinismo congênito está associado às mutações de SUR-1 e Kir6.2, glucoquinase, glutamato desidrogenase, 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase de cadeia curta e expressão ectópica de SLC16A1 na membrana plasmática das células beta. O HI pode estar associado ao estresse perinatal, como asfixia do nascimento, toxemia materna, prematuridade ou retardo do crescimento intra-uterino, resultando em hipoglicemia neonatal prolongada. Mimetismo de HI neonatal inclui pan-hipopituitarismo, hipoglicemia induzida por fármaco, insulinoma, anticorpos antiinsulina e estimuladores do receptor de insulina, síndrome de Beckwith-Wiedemann e distúrbios congênitos de glicosilação. Exames laboratoriais para HI podem incluir quantificação de glicose, insulina, β-hidroxibutirato, ácidos graxos, amônia e perfil de acilcarnitinas plasmáticos, além de ácidos orgânicos urinários. Os exames genéticos estão disponíveis em laboratórios comerciais para os genes sabidamente associados à hiperinsulinemia. Testes de resposta insulínica aguda (RIA) são úteis na caracterização fenotípica. Exames de imagem e histológicos também estão disponíveis para diagnosticar e classificar o HI. O objetivo do tratamento de crianças com HI é prevenir os danos cerebrais da hipoglicemia, mantendo níveis de glicose plasmática acima de 70mg/dl por terapia farmacológica ou cirúrgica. CONCLUSÃO:A terapêutica do HI requer abordagem multidisciplinar que inclui endocrinologistas pediátricos, radiologistas, cirurgiões e patologistas, os quais são treinados para diagnosticar..

BACKGROUND: Hypoglycemia in infants and children can lead to seizures, developmental delay, and permanent brain damage. Hyperinsulinism (HI) is the most common cause of both transient and permanent disorders of hypoglycemia. HI is characterized by dysregulated insulin secretion, which results in persistent mild to severe hypoglycemia. The various forms of HI represent a group of clinically, genetically, and morphologically heterogeneous disorders. CONTENT: Congenital hyperinsulinism is associated with mutations of SUR-1 and Kir6.2, glucokinase, glutamate dehydrogenase, short-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, and ectopic expression of SLC16A1 on β-cell plasma membrane. Hyperinsulinism may be associated with perinatal stress such as birth asphyxia, maternal toxemia, prematurity or intrauterine growth retardation, resulting in prolonged neonatal hypoglycemia. Mimickers of hyperinsulinism include neonatal panhypopituitarism, drug-induced hypoglycemia, insulinoma, antiinsulin and insulin-receptor stimulating antibodies, Beckwith-Wiedemann Syndrome, and congenital glycosylation disorders. Laboratory testing for hyperinsulinism may include quantification of blood glucose, plasma insulin, plasma β-hydroxybutyrate, plasma fatty acids, plasma ammonia, plasma acylcarnitine profile and urine organic acids. Genetic testing is available at commercial laboratories for genes known to be associated with hyperinsulinism. Acute insulin response (AIR) tests are useful in phenotypic characterization. Imaging and histological tools are also available to diagnose and classify hyperinsulinism. The goal of treatment in infants with hyperinsulinism is to prevent brain damage from hypoglycemia by maintaining plasma glucose levels above 700 mg/l (70 mg/dl) through pharmacologic or surgical therapy. SUMMARY: The treatment of hyperinsulinism requires a multidisciplinary approach that includes pediatric endocrinologists, radiologists, surgeons, and pathologists who trained to diagnose...

Diagnóstico molecular de un caso de Deficiencia de Acil CoA Deshidrogenasa de Cadena Media (MCADD) detectado por MS/MS / Molecular diagnosis of a case of Acyl CoA dehydrogenase medium chain (MCADD) detected by MSIMS

La deficiencia de Acil CoA Deshidrogenasa de Acidos Grasos de Cadena Media (MCADD) es el trastorno de la B-oxidación más comúnmente diagnosticado en humanos. Se hereda de forma autosómica recesiva y presenta una frecuencia que varía entre 1:4900 y 1:25000. La mutación más frecuente es la A985G que se observa en condición homocigoto en 81 por ciento de los casos y heterocigoto compuesto en 18 por ciento. El bloqueo enzimático lleva a la acumulación de ésteres de acilcarnitinas de cadena media lo cual permite la detección temprana de la enfermedad mediante el análisis de Espectrometría de Masas (MS/MS) y su posterior confirmación molecular. El primer caso de MCADD en Costa Rica fue detectado por MS/MS en el Laboratorio Nacional de Tamizaje y la presencia de la mutación A985G fue confirmada por métodos moleculares. La mutación afecta una región lejana del sitio activo que participa en el empaquetamiento de la proteína, proceso que es asistido por las chaperonas moleculares. Hasta la fecha, el paciente permanece asintomático lo cual podría explicarse por una serie de factores genéticos y ambientales que permiten mantener, parcialmente, la actividad de la enzima